Избор медија за биофилтер за бас велике уста- Карактеристике биофилма и учинак раста
бранцин (Мицроптерус салмоидес), такође познат као калифорнијски бас, припада Ацтиноптеригии, Перциформес, Центрарцхидае, Мицроптерус. Пореклом је из Калифорније, САД, и има предности као што су брз раст, укусан укус, богата исхрана и висока економска вредност. Постала је једна од важних слатководних врста аквакултуре у Кини. Последњих година, у позадини трансформације и унапређења рибарства и снажног развоја дигиталног и интелигентног рибарства, постепено се појавила индустријализована рециркулацијска аквакултура. Режим аквакултуре великоустог бранцина такође прелази са традиционалне рибњачке културе на зелени и ефикасан режим рециркулације аквакултуре. Рециркулацијска аквакултура има предности као што су уштеда воде и земљишта, велика густина насељености и практично управљање. Физичким, биолошким, хемијским методама и опремом, чврсте суспендоване материје и штетне материје у водном телу се уклањају или претварају у безопасне материје, тако да квалитет воде задовољава нормалне потребе раста гајених врста, чиме се остварује рециклажа воде у условима аквакултуре високе{6}}густине. Постигао је добре економске користи у више култивираних врста.
Тренутно се истраживања о рециркулирајућој аквакултури бранцина углавном фокусирају на репродукцију, исхрану сточне хране, селекцију сојева, прецизно храњење, промене водене средине и квалитет исхране. Истраживања о индустријској рециркулационој аквакултури бранцина у затвореном простору углавном се фокусирају на узгој велике-млади рибе, а узгој одраслих риба пуног-циклуса није широко промовисан. Главни изазов са којим се суочава аквакултура са рециркулацијом бранцина је одржавање доброг воденог окружења у условима велике-густине како би се обезбедио нормалан раст узгајаних врста. Пречишћавање воде је срж рециркулацијске аквакултуре, а ефикасни медијуми за биофилтере за третман воде су основа система за пречишћавање воде. Иако постоји много извештаја о пречишћавању воде биофилтерским медијумима, недостају извештаји посебно о индустријализованој рециркулационој аквакултури крупног бранцина, посебно у вези са скринингом ефикасних биофилтерских медија за третман воде, структуром микробне заједнице биофилма на различитим биофилтерским медијима, ефектима третмана и утицајима на раст узгајаних врста. Одабрана су три типа биофилтерских медија, међу којима су квадратни сунђер и биофилтерски медијум са флуидизованим слојем који су јефтини-и једноставни за руковање и широко се користе у третману репне воде у аквакултури; Мутаг Биоцхип 30 (скраћено Биоцхип) је нови тип биофилтер медија који се појавио последњих година, са предностима отпорности на ударце и дугог века трајања, али ефекти његове практичне примене нису пријављени. У ту сврху, 16С рДНК високо{12}}технологија секвенцирања коришћена је за анализу ситуације формирања биофилма у три медија за пречишћавање воде за биофилтере, док је истовремено анализирана ситуација раста бранцина, како би се издвојили практични медијуми за пречишћавање воде за биофилтерске медије и обезбедили ефикасне медијуме за пречишћавање воде за велике усне басове који индустријски рецикулишу.
1. Материјали и методе
1.1 Испитни материјали
Биофилтерски медијуми одабрани за овај тест су биликвадратни сунђер, Биоцхип, илопта са флуидизованим слојем, као што је приказано уСлика 1. Материјал квадратног сунђера је полиуретан, обликован као коцка са дужином странице од 2,0 цм, специфичне површине (3,2~3,5)×10⁴ м²/м³. Биочип материјал је полиетилен, у облику круга пречника 3,0 цм, дебљине око 0,11 цм, специфичне површине 5,5×10³ м²/м³. Материјал кугле са флуидизованим слојем је полиетилен, ефективне специфичне површине 500~800 м²/м³.
1.2 Експериментално груписање
Група за третирање подлоге са биофилтерским сунђером постављена је као група Т1, одговарајући биофилм медијума је означен Б1, а одговарајућа вода за аквакултуру је означена као В1; група за третман биофилтерске подлоге Биоцхип постављена је као група Т2, одговарајући биофилм медијума означен је са Б2, а одговарајућа вода за аквакултуру означена је са В2; група за третман биофилтера са кугличним слојем у флуидизованом слоју је постављена као група Т3, одговарајући биофилм медијума означен је са Б3, а одговарајућа вода за аквакултуру означена је са В3.
1.3 Систем аквакултуре
Експеримент је спроведен у рециркулацијском систему аквакултуре у Свеобухватној експерименталној бази Балидиан Института за слатководно рибарство Зхејианг.Укупно је било 9 резервоара за културу, запремине 500 Л, ефективне запремине воде 350 Л. Биофилтер резервоар је направљен од пластичног акваријума дужине 80 цм, ширине 50 цм и висине 50 цм, запремине 200 Л, ефективне запремине воде 120 Л.. Резервоар за културу и резервоар за биофилтер су повезани помоћу водене пумпе да би се формирала унутрашња циркулација, брзина протока 3~4 Л/мин, са аерацијом за оксигенацију, кисеоником раствореним у води одржаваним изнад 5 мг/Л. Биофилтерски медијуми су насумично груписани, сваки тип биофилтерског медијума је имао 3 понављања, сваки биофилтерски резервоар је напуњен са 2,0 кг биофилтерског медијума, док је истовремено суспендован извор угљеника са спорим{7}}ослобађањем. Током периода културе биофилма, дневно се мењало 10% воде.Почетни индикатори квалитета воде: Укупни азот (ТН) 9,41 мг/Л, Укупни фосфор (ТП) 1,02 мг/Л, Амонијачни азот (ТАН) 1,26 мг/Л, Нитритни азот (НО₂⁻-Н) 0,04 мг/Л, Перман. мг/Л.
1.4 Тестирање рибе и управљање културом
Као култивисана врста коришћен је бранцин. Пре почетка теста, аклиматизовани су у рециркулационој води 7 дана.Тест је спроведен од 11. августа 2022. до 22. септембра 2022. године у трајању од 42 дана. Велики бас без површинских повреда, здрав и живахан, одабран је за груписање, 60 риба је похрањено у сваком резервоару за културу, храњено два пута дневно, време храњења је било 07:00 ујутро и 16:00 поподне, дневна количина храњења је износила око 1,0%~1,5% укупне телесне масе рибе. Почетна маса тела испитиване рибе износила је (20,46 ± 0,46) г.
1.5 Сакупљање узорака
Узорци воде из резервоара за биофилтер су сакупљани свака 2 дана, бележећи индикаторе као што су температура воде, растворени кисеоник, пХ вредност и мерење амонијачног азота и нитрита. Забележена је количина храњења, телесна маса рибе на почетку и на крају експеримента и стопа преживљавања. После експеримента, 1 Л воде из сваког резервоара за културу је сакупљен коришћењем стерилних кеса за сакупљање воде, филтриран кроз филтерску мембрану од 0,22 µм и чуван у замрзивачу од -80 степени за каснију употребу. Узорци биофилтерских медија од 0,5 г узети су асептично из сваког резервоара за биофилтер, ускладиштени у стерилизованој дестилованој води, снажно промућкани да би се уклонили микроорганизми са површине биофилма, затим филтрирани кроз филтерску мембрану од 0,22 µм и чувани у замрзивачу од -80 степени за каснију употребу.
1.6 Методе мерења
1.6.1 Мерење квалитета воде
Температура воде, растворени кисеоник и пХ вредност су детектовани коришћењем аХАЦХ Хк40д преносиви анализатор квалитета воде. Концентрација амонијачног азота је мерена Несслеровом спектрофотометријском методом реагенса. Концентрација азота нитрита је детектована спектрофотометријском методом хлороводоничне киселине нафтилетилендиамин.
1.6.2 Мерење перформанси аквакултуре
Формуле за прорачун за стопу прираста, однос конверзије хране и стопу преживљавања риба су следеће.
l Стопа повећања телесне тежине= (Коначна телесна маса рибе - Почетна маса тела рибе) / Почетна маса тела × 100%;
l Однос конверзије фида= Потрошња хране / Прираст;
l Стопа преживљавања= (Број риба на крају експеримента / Почетни број риба на почетку експеримента) × 100%.
1.6.3 Микробно секвенционирање високог{1}}пропуста
Бактеријска ДНК је екстрахована из воде и биофилма коришћењем комплета за екстракцију бактеријске ДНК (ОМЕГА Биотецх, САД). Специфични прајмери 338Ф (5'–АЦТЦЦТАЦГГГАГГЦАГЦАГ–3') и 806Р (5'–ГГАЦТАЦХВГГГТВТЦТААТ–3') су коришћени за амплификацију В3 и В4 региона бактеријске 16С рДНК. ПЦР је користио реакциони систем ТрансГен АП221-02: 4 µЛ 5×ФастПфу пуфера, 2 µЛ 2,5 ммол/Л дНТПс, 0,4 µЛ ФастПфу полимеразе, 0,8 µЛ сваки од 5 µмол/Л, 0 µЛ прајмера унапред и реверзно БСА ДНК шаблон, допуњен са ддХ2О до 20 µЛ. Услови ПЦР реакције: 95 степени током 3 мин; 95 степени за 30 с, 53 степена за 45 с, 72 степена за 1 мин, 28 циклуса; Продужење за 72 степена 10 мин. ПЦР амплификација је изведена на инструменту за ПЦР реакцију 9700 (Апплиед Биосистемс® ГенеАмп®, САД). ПЦР производи су пречишћени коришћењем перли и затим подвргнути секвенцирању. Секвенцирање је наручено компанији Схангхаи Мајорбио БиоПхарм Тецхнологи Цо., Лтд.
1.6.4 Анализа микробне разноврсности
Необрађени подаци добијени секвенцирањем су прво спојени, након чега је уследило филтрирање контроле квалитета квалитета читања и ефекта спајања, и корекција смера секвенце, што је резултирало оптимизованим подацима. Након нормализације коначно добијених чистих података, ОТУ (Оператионал Такономиц Унитс) кластерска анализа и таксономска анализа су обављене са 97% сличности. Хистограми узорака су нацртани помоћу Екцел-а, а топлотне мапе су нацртане коришћењем Мајорбио Цлоуд Платформе.
1.7 Анализа података
За анализу значајности разлика коришћен је статистички софтвер СПСС 16.0, а за вишеструка поређења коришћен је Данканов метод у анализи варијансе (АНОВА).
2. Резултати и анализа
2.1 Време формирања биофилма различитих биофилтерских медија
Као што је приказано уСлика 2,у условима природног формирања биофилма, садржај амонијачног азота у води резервоара за биофилтер показао је тренд брзог пораста праћеног постепеним опадањем.Садржај амонијачног азотау води биофилтерског резервоара који одговара квадратном сунђеру достигао је свој врхунац за 17 дана, на 8,13 мг/Л, а затим се постепено смањивао,достижући најнижу на 41 дан, након чега остаје око 0,20 мг/Л, што указује на товреме формирања биофилма за квадратни сунђер било је око 17 дана. Промене у садржају амонијачног азота у води резервоара биофилтера који одговарају Биоцхипу и кугли са флуидизованим слојем су у основи биле исте, показујући флуктуирајуће промене. Пик амонијачног азота појавио се након 21 дана, на 7,88 мг/Л односно 7,57 мг/Л, што указује давреме формирања биофилма за Биоцхип и биофилтерски медијум са кугличним флуидизованим слојем било је око 21 дан. Садржај амонијачног азотау резервоарима биофилтера који одговарајуова два медија су пала на најнижу на 43 дана, односно 45 дана.
2.2 Промене пХ вредности воде у различитим резервоарима за културу
ОдСлика 3, може се видети да је почетна пХ вредност воде за културу била 7,3. Како се време култивисања продужавало, пХ вредност воде у сваком резервоару за културу показала је опадајући тренд. После 12 дана пХ вредност свих резервоара за културу била је мања од 6,0, што је неповољно за раст култивисане врсте.Стога, након 12 дана формирања биофилма, треба обратити пажњу на подешавање пХ вредности воде у резервоару за културу..
2.3 Анализа састава микробне заједнице на биофилмима различитих биофилтерских медија и у води
2.3.1 Састав микробне заједнице на нивоу типа
Као што је приказано уСлика 4,на нивоу типа, доминантне бактерије на биофилмима три биофилтерска медија су биле исте, а све су биле Протеобацтериа, Ацтинобацтериота, Бацтероидота и Цхлорофлеки. Њихова комбинована релативна заступљеност износила је 68,96%, 64,74% и 65,45% респективно. Доминантне бактерије у одговарајућој води за културу биле су различите. Доминантна бактерија у В1 била је Ацтинобацтериота, са релативном заступљеношћу од 64,66%. Доминантне бактерије у В2 и В3 биле су Протеобактерије, са релативном заступљеношћу од 34,93% и 50,10% респективно.
Фиг. 4 Састав заједнице бактерија у различитим биофилмима и води на нивоу типа
2.3.2 Састав микробне заједнице на нивоу породице
Као што је приказано уСлика 5, на биофилмовима три медија, око 48% бактерија су биле бактеријске заједнице са релативном заступљеношћу све мање од 3%. Доминантне бактерије Б1 и Б2 су биле исте, обе су биле Ксантхомонадацеае, са релативном заступљеношћу од 11,64% и 9,16% респективно; доминантна бактерија Б3 била је ЈГ30-КФ-ЦМ45, са релативном заступљеношћу од 10,54%. Доминантне бактерије у води за културу биле су различите од оних на медијуму биофилтера. Мицробацтериацеае је била апсолутно доминантна бактерија у В1, са релативном заступљеношћу од 62,10%; доминантне бактерије у В2, поред Мицробацтериацеае (13,82%), укључивале су и одређени удео Рхизобиалес (8,57%); доминантна бактерија у В3 била је Рхизобиалес, са релативном заступљеношћу од 38,94%, а затим Флавобацтериацеае, са релативном заступљеношћу од 15,89%.
Пребројано је 50 најбољих врста на нивоу рода. Након обраде нумеричких вредности, промене у обиљу различитих врста у узорцима су приказане кроз градијент боја блокова боја. Резултати су приказани уСлика 6. Леифсониа је била доминантна бактерија у В1, са релативном заступљеношћу од 56,16%; доминантне бактерије у В2 биле су Леифсониа (10,30%) и Рхизобиалес_Инцертае_Седис (8,47%); доминантна бактерија у В3 била је Рхизобиалес_Инцертае_Седис, са релативном заступљеношћу од 38,92%. Међу бактеријама које се могу идентификовати на биофилмовима, Тхермомонас је био доминантан род у Б1, са релативном заступљеношћу од 4,71%; доминантни родови у Б2 и Б3 били су Нитроспира, са релативном заступљеношћу од 4,41% и 2,70% респективно.
Фиг. 5 Састав заједнице бактерија у различитим биофилмимаи вода на нивоу породице
Фиг. 6 Топлотна карта састава бактеријске заједнице у различитим биофилмима и води на нивоу рода
2.4 -Анализа разноликости микробних заједница на биофилмовима различитих биофилтерских медија и у води
Као што је приказано уТабела 1, Шенонов индекс микробних заједница на биофилмовима различитих подлога био је већи од индекса одговарајуће воде за културу, док је Симпсонов индекс био супротан. Анализирајући одговарајућу воду за културу, Шенонов индекс бактеријске заједнице В2 је био највиши, значајно већи од индекса В1 и В3, док је Симпсонов индекс био значајно нижи од индекса В1 и В3, што указује на њену -разноврсност највећа. За разлику од -разноврсности воде за културу, иако је Шенонов индекс бактеријске микробне заједнице у медијуму Б2 био највећи, а Симпсонов индекс најмањи, није било значајне разлике између три медија биофилтера. Покривеност секвенционирања свих узорака била је изнад 0,990, што указује да дубина секвенцирања може одражавати прави ниво узорака.
2.5 Ефекти различитих биофилтерских медија на раст бас баса
Табела 2приказује ситуацију раста великог баса у различитим групама биофилтерских медија. После 44 дана култивисања, коначна телесна маса и стопа повећања телесне масе баса у групи са четвртастим сунђером били су значајно већи од оних у групама са куглицом са флуидизованим слојем и Биочип групама, а однос конверзије хране био је значајно нижи од оног у другим групама. Стопа преживљавања бранцина у свакој групи била је изнад 97%, без значајне разлике међу групама.
3. Закључак и дискусија
3.1 Време формирања биофилма различитих биофилтерских медија
Биофилмови се причвршћују на површину медија биофилтера. Материјал, структура и специфична површина медија биофилтра су главни фактори који утичу на формирање биофилма. Постоје две уобичајене методе за узгој биофилма: метода формирања природног биофилма и метода формирања инокулисаног биофилма. Различите методе формирања биофилма утичу на време сазревања биофилма. Ху Ксиаобинг и др. користио четири различите методе за формирање биофилма, а резултати су показали да када се користе методе као што су додавање хитозана, јона гвожђа и инокулација испуштеним муљем за формирање биофилма, време сазревања биофилма је било краће него код методе формирања природног биофилма. Иако додавање корисних микроорганизама или активних супстанци може скратити време формирања биофилма, постоје проблеми као што су тешкоће у добијању инокулума, сложена конструкција процеса и висока цена. Гуан Мин и сарадници, у условима ниског садржаја органске материје, директно су користили сирову воду за формирање биофилма, а резервоар биофилтра успешно је покренут кроз стварање природног биофилма након око 38 дана. Овај резултат истраживања је сличан резултатима ове студије. Резултати овог истраживања показују да је под истим условима формирања биофилма време формирања биофилма на четвртастом сунђеру било краће него код друга два биофилтерска медија. Ово може бити повезано са великом специфичном површином, снажном хидрофилношћу и лакоћом везивања биофилма четвртастог сунђера. Специфична површина квадратног сунђера је чак 32.000~35.000 м²/м³, много већа од друга два медија. Штавише, материјал четвртастог сунђера је полиуретан, који се шири када је изложен води, има високу хидрофилност и погодан је за везивање и раст микроорганизама у води. Резултати истраживања Ли Јонга и сар. такође је показао да су перформансе покретања-и перформансе уклањања амонијачног азота код полиуретанског сунђера биле боље од оних код полипропилена, што је у складу са резултатима ове студије. Поред тога, у овој студији, специфична површина биофилтерског медија Биоцхип била је чак 5.500 м²/м³, много већа од површине биофилтерског медија са флуидизованим слојем, али време формирања биофилма је у основи било исто као код кугличног медија са флуидизованим слојем. Ово може бити повезано са величином пора. Неке студије су истакле да унутрашња просторна скала биофилтерских медија утиче на раст биофилма. Иако неки медијуми за биофилтер имају велику специфичну површину, њихове поре су фине, а величина пора је много мања од дебљине зрелог биофилма, што лако може довести до блокаде пора, што отежава биофилму у порама да достигне максималну акумулацију. Поре Биочипа су мале, што резултира споријим растом биофилма и дужим временом формирања биофилма.
3.2 Састав микробне заједнице биофилтерске подлоге и воде за културу
У овој студији, доминантне бактерије на медијуму биофилтера и у одговарајућој води за културу биле су различите. Шенонов индекс биофилма на биофилтерској подлози био је већи од индекса одговарајуће воде за културу, што указује да биофилтерски медијуми обогаћују микроорганизме. Ово је у складу са резултатима истраживања Ху Гаоиу ет ал. Постоји много фактора који утичу на структуру микробне заједнице, као што су тип носача, дубина филтера, салинитет, концентрација органске материје, итд. Исти биофилтерски медијум, под различитим условима културе, имаће различите микробне заједнице на биофилму. Аутор је једном проучавао ситуацију формирања биофилма у биофилтерском медијуму са кугличним флуидизованим слојем у систему за рециркулацију аквакултуре за џиновске слатководне козице (Мацробрацхиум росенбергии). Резултати су показали да је доминантан тип на његовом биофилму био Фирмицутес, док је у овој студији доминантан тип на биофилму кугле у флуидизованом слоју био Протеобацтериа. Главни разлог за ову разлику може бити различито окружење аквакултуре. Три биофилтерска медија коришћена у овој студији имала су исте почетне услове за култивацију биофилма. Могуће је да су због различитих физичких карактеристика медија, формирана дебљина биофилма и унутрашње окружење такође били различити, што је резултирало разликама у микробним заједницама. Стога је разлика у носиоцима главни разлог за разлике у микробним заједницама. Штавише, током процеса аквакултуре, водена средина и микробна заједница утичу једни на друге. Разлози за разлике у микробним заједницама могу бити повезани са факторима средине. На пример, истраживање Јуан Цуилина је показало да је укупан број хетеротрофних бактерија у телу; Фан Тингиу и др. верује да пХ вредност може значајно утицати на укупан садржај азота у води, и да игра кључну улогу у дистрибуцији водених бактеријских заједница у унутрашњим речним деловима. Амонијачни азот, укупни фосфор и хлорофил а такође утичу на састав бактеријских заједница у водном телу у различитом степену. Фактори животне средине који узрокују разлике у саставу микробне заједнице у овој студији још увек требају даљу потврду.
3.3 Ефекти различитих биофилтерских медија на раст великог баса
Из резултата раста, бас са великим устима у групи четвртастог сунђера растао је најбрже, са стопом повећања тежине знатно већом него код друга два медија, и најнижим односом конверзије хране. Ово је у складу са резултатима претходних истраживања. У овој студији, формирање биофилма и аквакултура су спроведени истовремено. Судећи по времену формирања биофилма, биофилм четвртастог сунђера је раније сазревао, а након сазревања биофилма концентрације амонијачног азота и нитритног азота у води су увек биле ниже од оних у друга два медија. Поред тога, четвртасти сунђер има одређени капацитет филтрације, садржај чврстих суспендованих чврстих материја у води за културу је био мањи, а вода је била релативно бистра. Бољи раст бранцина у групи четвртастог сунђера може бити повезан са добрим квалитетом воде. Међутим, ефекти пречишћавања квадратног сунђерастог медијума на укупан азот, укупни фосфор и индекс перманганата у води захтевају даље проучавање. Вреди напоменути да је током експеримента пХ вредност показала укупан тренд пада. После 12 дана културе, пХ вредност свих резервоара за културу била је мања од 6,0, што је у складу са резултатима истраживања Зханг Лонга и сар. Смањење пХ вредности је због тога што се током процеса култивације биофилма производи велики број јона водоника, што доводи до смањења пХ вредности воде. Због тога, током процеса формирања биофилма, неопходно је благовремено прилагодити пХ вредност воде у резервоару за културу како би се осигурало да је унутар нормалног опсега раста култивисане врсте. Узимајући у обзир економске трошкове, тржишна цена квадратног сунђера је 70 ~ 100 РМБ/кг, а његова цена је између друга два медија биофилтера. У комбинацији са резултатима раста, краткорочно гледано, квадратни сунђер је релативно практичан биофилтерски медиј за третман воде за рециркулишућу аквакултуру. Међутим, квадратни сунђер има слабу жилавост и кратак радни век. Његови-дугорочни ефекти употребе и ефекти на аквакултуру захтевају даљу проверу.
Укратко,у условима природног формирања биофилма, биофилтерски медиј са четвртастим сунђером има најкраће време формирања биофилма, умерену цену, а коначна телесна маса и стопа повећања телесне масе баса у групи са четвртастим сунђером били су значајно већи од оних у друга два биофилтерска медија. Краткорочно гледано, то је релативно практичан биофилтерски медиј за третман воде за рециркулишућу аквакултуру.